促日本血吸虫肝脏纤维化的mirna分子及mirna拮抗剂和应用
技术领域
1.本发明涉及寄生虫分子生物学领域，尤其涉及促日本血吸虫肝脏纤维化的mirna分子及mirna拮抗剂和应用。


背景技术：

2.日本血吸虫引起的血吸虫病在中国曾是一个严重的公共卫生问题。肝脏肉芽肿和肝纤维化是日本血吸虫病的主要病理特征。寄生在宿主肝脏的日本血吸虫虫卵会被免疫细胞浸润并包围形成肉芽肿，其中日本血吸虫虫卵会释放一系列的外泌体来调控其生存环境，并且可借外泌体来对宿主的免疫实现“逃避”以达到生存的目的，但是，日本血吸虫虫卵源性外泌体在肝纤维化中的作用和机制尚不清楚。
3.研究发现，过度积累且无法及时被降解的细胞外基质(extracellular matrix，ecm)在肝纤维化进程中起着主导作用，而ⅰ型胶原是宿主肝细胞间隙过度累积的ecm主要成分；从而使得细胞外基质过度的转录和分泌，进而造成宿主的肝脏纤维化，从而分泌一系列促进宿主自身发生肝脏纤维化的因子，如：egf、tgf-β等，而肝星状细胞的增殖活化与转分化，则会打破宿主肝脏原有的ecm合成与降解平衡，从而导致ecm的过量累积不能被及时的消化，进而使得肝脏原有的生理平衡状态被打破，导致纤维化的发生。日本血吸虫卵中的可溶性抗原可以抑制hsc活化，诱导活化hsc衰老并促进hsc凋亡，从而控制肝纤维化的进展。然而，详细的分子机制仍不清楚。外泌体，亦有称细胞外囊泡(ev)的，它含有量大且复杂的生物学分子，例如：蛋白质、脂质和核酸等，用于长距离信息交换。各种寄生虫分泌的ev已成为宿主与寄生虫交流的重要途径。研究表明，寄生虫的ev可以包装特定的mirna，并且寄生虫ev将mirna转移到宿主并提供寄生虫与宿主之间的串扰。
4.微小rna(microrna，mirna)，在生物学上通常是由十八至二十四个核糖核苷酸组成的小单链rna分子。近年来，随着对血吸虫外泌体mirna的深入研究，不仅为宿主肝脏纤维化的诊断，也为血吸虫病的防治提供了依据。在肝纤维化的不同时期，来自虫源和宿主源的mirna通过各种方式来调控肝纤维化的进程，或通过与靶mrna的特异性结合，从而增强靶mrna的稳定性来促进宿主肝纤维化的进程，或是与靶mrna互补配对降解靶基因的，抑制靶mrna的生物学功能来抑制或者减轻宿主肝纤维化进程。


技术实现要素：

5.如果找到了影响宿主肝纤维化的关键或较关键mirna，合成相应的mirna拮抗剂(mirnaantagomir)，则可能有利于治疗和缓解日本血吸虫带来的宿主肝纤维化。本发明从这个目的出发，公开了一种促日本血吸虫肝脏纤维化的mirna分子。所述促日本血吸虫肝脏纤维化的mirna分子为novel mirna-30、novel mirna-33、novel mirna-68、novel mirna-30mimic、novel mirna-33mimic、novel mirna-68mimic、novel mirna-30agomir、novel mirna-33agomir或novel mirna-68agomir；
6.novel mirna-30、novel mirna-33、novel mirna-68为单链结构，其核苷酸序列分
别为seq id no.10、seq id no.1、seq id no.8，或者分别为seq id no.10、seq id no.1、seq id no.8经过添加、缺失、修饰和/或保守性置换至少1个核苷酸获得的核苷酸序列；
7.novel mirna-30mimic、novel mirna-33mimic、novel mirna-68mimic、novel mirna-30agomir、novel mirna-33agomir、novel mirna-68agomir为双链结构，其核苷酸序列分别为seq id no.10、seq id no.1、seq id no.8、seq id no.10、seq id no.1、seq id no.8，或者分别为seq id no.10、seq id no.1、seq id no.8、seq id no.10、seq id no.1、seq id no.8经过添加、缺失、修饰和/或保守性置换至少1个核苷酸获得的核苷酸序列。
8.在一些实施方案中，novel mirna-30mimic、novel mirna-33mimic、novel mirna-68mimic均属于micron
tm mirna mimic；novel mirna-30agomir、novel mirna-33agomir、novel mirna-68agomir均属于micron
tm mirna agomir。
9.另一方面，本发明还公开了如上所述的促日本血吸虫肝脏纤维化的mirna分子在制备治疗日本血吸虫病药物方面的应用；治疗日本血吸虫病药物的有效成分包含novel mirna-30antagomir、novel mirna-33antagomir和/或novel mirna-68antagomir；novel mirna-30antagomir、novel mirna-33antagomir、novel mirna-68antagomir的核苷酸序列分别包含novel mirna-30agomir、novel mirna-33agomir、novel mirna-68agomir正义链核苷酸序列的互补序列。
10.进一步地，治疗日本血吸虫病药物具有缓解或阻断肝纤维化的作用。
11.第三方面，本发明还公开了一种抑制日本血吸虫mirna的拮抗剂，抑制日本血吸虫mirna的拮抗剂是针对日本血吸虫虫卵源性外泌体源的novel mirna-30、novel mirna-33或novel mirna-68的拮抗剂，即是novel mirna-30antagomir、novel mirna-33antagomir或novel mirna-68antagomir；novel mirna-30、novel mirna-33、novel mirna-68为单链结构，其核苷酸序列分别为seq id no.10、seq id no.1、seq id no.8，或者分别为seq id no.10、seq id no.1、seq id no.8经过添加、缺失、修饰和/或保守性置换至少1个核苷酸获得的核苷酸序列。
12.在一些实施方案中，novel mirna-30antagomir、novel mirna-33antagomir、novel mirna-68antagomir的核苷酸序列分别包含novel mirna-30、novel mirna-33、novel mirna-68核苷酸序列的互补序列。
13.在一些实施方案中，novel mirna-30antagomir、novel mirna-33antagomir、novel mirna-68antagomir的核苷酸序列分别为seq id no.33、seq id no.2、seq id no.32，或者分别为seq id no.33、seq id no.2、seq id no.32经过添加、缺失、修饰和/或保守性置换至少1个核苷酸获得的核苷酸序列。
14.在一些实施方案中，novel mirna-30antagomir、novel mirna-33antagomir、novel mirna-68antagomir均为单链结构，全链进行甲基化修饰，在5’端和3’端分别有2个和4个碱基硫代修饰，并在3’端连接有胆固醇修饰。进一步地，3’端连接有高亲和性胆固醇修饰。
15.在一些实施方案中，novel mirna-30antagomir、novel mirna-33antagomir、novel mirna-68antagomir均属于microff
tm mirna antagomir。
16.micron
tm mirna mimic、micron
tm mirna agomir和microff
tm mirna antagomir为广州市锐博生物科技有限公司(锐博生物，ribobio)的三种类型的产品。本发明具体实施方
68可上调α-sma、col 1α1和col 3α1的mrna水平和蛋白质水平，可调节人肝星状细胞以及小鼠的纤维化进程，表明novel mirna-30、novel mirna-33、novel mirna-68可通过跨物种的方式促进宿主的肝纤维化进程；
32.5)采用novel mirna-33antagomir抑制novel mirna-33后，可降低novel mirna-33对宿主肝脏的纤维化程度，为治疗日本血吸虫病药物的开发带来新的方向，尤其是开发治疗日本血吸虫感染后引起的肝脏纤维化；
33.6)来自日本血吸虫虫卵源性外泌体的novel mirna-33antagomir通过tgf-β/smad3信号通路促进肝纤维化。
34.novel mirna-33antagomir具有成为治疗日本血吸虫病药物有效成分的巨大潜力。同样具有上调α-sma、col 1α1和col 3α1的mrna水平和蛋白质水平作用的novel mirna-30和novel mirna-68，其各自的antagomir也同样具有成为治疗日本血吸虫病药物有效成分的巨大潜力。
35.以下将结合附图和实施例对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
36.图1是来自日本血吸虫虫卵源外泌体mirna对宿主肝纤维化的影响的研究概要图。
37.图2是日本血吸虫虫卵源性外泌体的鉴定以及外泌体可促进肝纤维化。(a)日本血吸虫虫卵源性外泌体标记物的western blotting检测。图中，exo表示外泌体组(exosomes组)；pbs表示pbs处理组，作为阴性参照。(b)日本血吸虫虫卵源性外泌体的透射电子显微镜(tem)分析。箭头所指为用透射电镜检测到的外泌体囊泡。(c)在日本血吸虫虫卵源性外泌体刺激lx-2人肝星状细胞(hsc)24小时后，通过qpcr测定平滑肌肌动蛋白(α-sma)、i型胶原α1(col 1α1)和iii型胶原α1(col 3α1)的mrna水平表达情况。图中，blank表示未经处理的lx-2细胞的分组；exo表示经外泌体刺激后的lx-2细胞的分组。注：α-sma、col 1α1和col 3α1的mrna水平采用gapdh标准化。这些数据是三个独立实验中的一个代表性实验的结果，studetn’s t检验用于评估两组之间的差异。本文中，*p《0.05，**p《0.001，***p《0.0005，***p《0.0001；ns表示无显著性差异。
38.图3是novel mirna-33mimic(图3中用novel 33表示)可激活lx-2。(a)用几种mirna mimic(图3中分别表示为novel 30、novel 33、novel 68、mir-1和nc mimic)转染lx-2细胞，培养24小时，并通过qpcr测定α-sma和col 1α1的mrna水平。(b)用几种novel mirna mimic(图3中分别表示为novel 30、novel 33、novel 68、mir-1和nc mimic)转染lx-2细胞，培养48小时，通过western印迹法测定α-sma和col 1α1的表达水平。novel 30、novel 33、novel 68、mir-1的结果与nc mimic的结果相比。图3中novel 30、novel 33、novel 68、mir-1的序列分别对应表2-3中novel mirna-30、novel mirna-33、novel mirna-68、mir-1的序列。
39.注：α-sma和col 1α1的蛋白表达水平标准化为gapdh表达。这些数据是三个独立实验中的一个代表性实验的结果，studetn’s t检验用于评估两组之间的差异。
40.图4是novel mirna-33agomir导致小鼠肝纤维化。在寄研所的spf级动物房饲养的6周龄雌性c57bl/6小鼠每周注射一次mirna agomir nc、novel mirna-33agomir或生理盐
水(正常组)，持续六周。结果与mirna agomir nc组相比，正常组仅作为参考。(a)用agomir novel 33六周后，小鼠肝脏和血清中的novel mirna-33显著增加。(b)qpcr结果显示α-sma、col 1α1和col 3α1在mrna水平上调。(c)western印迹结果显示α-sma、col 1α1和col 3α1的蛋白质水平上调。
41.注：α-sma、col 1α1和col 3α1的蛋白表达水平标准化为gapdh，mirna的表达标准化为u6。这些数据是三个独立实验中的一个代表性实验的结果，studetn’s t检验用于评估两组之间的差异。
42.图5是对novel mirna-33的抑制可降低小鼠肝纤维化的程度。6周龄雌性c57bl/6小鼠经皮暴露于20
±
1条日本血吸虫尾蚴，在小鼠感染日本血吸虫尾蚴7天后，通过尾静脉注射120μl 20nm mirna拮抗剂antagomir nc(ribo)、mirna拮抗剂antagomir novel 33(ribo)或生理盐水，每周一次，持续6周。masson染色图像被放大10倍，免疫荧光图像被放大20倍。小鼠的肝组织被用于总rna的提取、总蛋白的提取、虫卵计数以及石蜡块的制作。(a，b)masson染色显示，经新型mirna-33拮抗剂治疗后，胶原区域减少。(c)小鼠肝组织中的虫卵计数显示三组之间(sj+antagomir nc组、sj+antagomir novel 33组与sj组)没有统计学差异。(d)novel mirna-33在感染日本血吸虫6周的小鼠中的表达。(e)免疫荧光图像显示，经novel mirna-33antagomir治疗后，i型胶原α1和α-sma下调。
43.注：α-sma、col 1α1和col 3α1的mrna水平标准化为gapdh，novel mirna-33的表达标准化为u6。这些数据是三个独立实验中代表性实验的结果，student’s t检验用于评估两组之间的差异，对三个或更多组使用单因素方差分析(anova)和tukey的后测。(荧光为spgreen；n＝20)。
44.图6是进一步体现对novel mirna-33的抑制可降低小鼠肝纤维化的程度。qpcr结果显示，相对于sj+antagomir nc组和sj组，经novel mirna-33antagomir治疗后α-sma、col 1α1和col 3α1的mrna水平下调。注释同图5。
45.图7是通过酶切位点cloning sites：saci(gagctc)和sali(gtcgac)将目的基因片段克隆到载体中所用到的载体图谱。
46.图8是novel mirna-33通过tgfβ/smad途径促进肝纤维化。用novel mirna-33mimic和mimic nc转染lx-2细胞。转染lx-2细胞24小时后提取总rna，转染lx-2细胞48小时后提取蛋白质。空白对照组(blank)不做任何治疗。结果与空白对照组相比，空白组仅作为参考。(a)novel mirna-33与tgf-βri 3’utr靶区的序列比对。(b)在没有或存在novel mirna-33mimic的情况下，对转染pmirglo tgf-βri 3'utr-wt或pmirglo tgf-βri-3'utr-mut的293t细胞进行荧光素酶报告分析。(c)qpcr结果显示novel mirna-33上调tgf-βri mrna水平的表达。(d)western印迹结果显示，novel mirna-33上调tgf-βri蛋白水平的表达。(e)smad3在用novel mirna-33转染lx-2细胞后磷酸化。
47.注：tgf-βri、smad3和p-smad3的表达标准化为gapdh表达。这些数据是三个独立实验中的一个代表性实验的结果，studetn’s t检验用于评估两组之间的差异。
具体实施方式
48.为了使发明实现的技术手段、创造特征、达成目的和功效易于明白了解，下结合具体图示，进一步阐述本发明。但本发明不仅限于以下实施的案例。
49.须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
50.1.1作为本发明基础的研究概述
51.本发明是基于在小鼠体内和体外(lx-2细胞内)两个水平，探究来自日本血吸虫虫卵源外泌体mirna对宿主肝纤维化的影响这个研究(图1)。
52.在体外实验，使兔子感染日本血吸虫尾蚴6周，六周后取兔子的肝脏组织经研磨和洗涤、消化后获取大量新鲜的日本血吸虫虫卵。之后将日本血吸虫虫卵培养在无菌的环境中以便后续实验获取外泌体。将收集到的日本血吸虫虫卵培养上清液超速离心，获取到新鲜的日本血吸虫虫卵源外泌体，之后将获取的外泌体送予欧易生物有限公司进行测序，经测序之后，获取到大量的mirna序列，将这些序列予以锐博生物合成在体外可以稳定保存的mirna模拟物(mimics)，在得到一系列的mirna模拟物之后，我们用这些mirna模拟物去转染人肝星状细胞(lx-2细胞)，在lx-2细胞分别被转染24和48小时后，转染结束后，检测lx-2细胞分别被在mrna水平和蛋白水平α-sma、col 1α1和col 3α1(col 3α1仅作为参考)的表达。并经过层层的筛选最终确定研究对象新型mirna-33(novel mirna-33)。
53.在体内实验中，将前述实验得到的novel mirna-33送予锐博生物合成用于动物实验的mirna体内模拟物(agomir)和mirna的拮抗剂(antagomir)，分别即novel mirna-33agomir和novel mirna-33antagomir。送ribo生物合成的mimic、agomir和antagomir分别采用micron
tm mirna mimic、micron
tm mirna agomir、microfftm antagomir产品技术。
54.首先，用novel mirna-33agomir对小鼠进行纤维化造模，以验证novel mirna-33可以使小鼠发生肝纤维化，并在小鼠用药novel mirna-33agomir六周后取肝脏和血清检测mirna的表达，并同时取小鼠的肝脏提取总rna和总蛋白，分别在mrna水平和蛋白水平检测α-sma、col 1α1和col 3α1的表达。其次用novel mirna-33antagomir对感染日本血吸虫小鼠进行治疗，以验证抑制novel mirna-33，可以使小鼠肝纤维化程度减轻，并在小鼠用药novel mirna-33antagomir六周后取肝脏和血清检测mirna的表达，并同时取感染治疗小鼠的肝脏组织提取总rna和总蛋白，分别在mrna水平和蛋白水平检测α-sma、col 1α1和col 3α1(col 3α1仅作为参考)的表达。并在确定novel mirna-33的作用靶基因后，进一步验证novel mirna-33的作用机制，以提高人们对日本血吸虫病肝纤维化过程的认识，为纤维化防治提供理论基础。
55.2.1实验仪器
56.本研究主要用到的实验仪器汇总。
57.表2-1主要仪器名称及品牌
[0058][0059][0060]
2.2试剂
[0061]
本研究的主要试剂汇总。
[0062]
表2-2主要试剂名称及品牌
[0063]
[0064][0065]
2.3主要试剂的配制
[0066]
(1)新鲜的dmem(1
×
)完全培养基的配制(不含双抗)：fbs(胎牛血清)的含量为10％，经寄研所的0.22μm滤网过滤混匀后，贴上寄研所的封口膜并且标记好配制日期，置于寄研所的冰箱4℃保存。
[0067]
(2)细胞所用1
×
pbs缓冲液的配制：20
×
pbs溶液与水的配制比例为1：20，混匀后贴上封口膜置于冰箱4℃在黑暗地条件下保存。
[0068]
(3)1
×
tbst的配制：50ml 20
×
tbs溶液加入0.5ml tween-20，混匀，用ddh2o定容至1l。室温保存。
[0069]
(4)1
×
电泳缓冲液的配制：取碧云天的电泳缓冲液粉剂溶解在ddh2o中，之后，用ddh2o定容至1l。，混匀，置于冰箱4℃在黑暗地条件下保存，以待后续实验的使用。
[0070]
(5)5
×
转膜缓冲液的配制：取完整包装的金斯瑞的转膜液粉剂，用ddh2o溶解，并定容至10l，混匀，于冰箱4℃在黑暗地条件下保存。
[0071]
(6)1
×
转膜缓冲液的配制：取在4℃保存的5
×
湿转转移缓冲液1l，并用ddh2o定容至5l，定容结束后加入1ml金斯瑞提供的泡沫消除剂，混匀，于冰箱4℃在黑暗地条件下保存。
[0072]
2.4实验材料
[0073]
实验动物：6周龄雌性c57bl/6小鼠购自上海吉惠实验动物有限公司，在中国疾病预防控制中心国家寄生虫病研究所(国家热带病研究中心)无特定病原体(spf)动物室饲养。雌性大白兔购自上海松联实验动物有限公司(中国上海)。日本血吸虫尾蚴由中国疾病预防控制中心(国家热带病研究中心)国家寄生虫病研究所提供。
[0074]
lx-2细胞株：在无锡欣润生物有限公司购买。
[0075]
2.5实验方法
[0076]
2.5.1动物模型
[0077]
2.5.1.1小鼠mirna agomir纤维化模型的建立
[0078]
将采购的36只6周龄雌性c57bl/6小鼠分为mirna agomir nc组(阴性对照组)、
novel mirna-33agomir组和生理盐水组。mirna agomir nc和novel mirna-33agomir溶解在无菌的生理盐水中。
[0079]
在mirna agomir nc组，9只小鼠通过尾静脉注射120μl 20nm mirna agomir nc(ribo生物)，每周一次，共持续8周。
[0080]
在novel mirna-33agomir组，18只小鼠经尾静脉注射120μl 20nm novel mirna-33agomir(ribo生物)，每周一次，共持续8周。
[0081]
在生理盐水组，9只小鼠经尾静脉注射120μl生理盐水，每周一次，共持续8周。
[0082]
从第一次静脉注射后的第6周开始采集小鼠的肝组织。
[0083]
注：mirna agomir nc、mirna mimic nc与mirna antagomir nc的序列分别经生物信息学筛选得到，均是几乎不与编码rna相作用的无意义序列。mirna agomir nc和mirna mimic nc为双链结构，且正义链均为5
’‑
uuuguacuacacaaaaguacug-3’(seq id no.4)；反义链均均为5
’‑
caguacuuuuguguaguacaaa-3’(seq id no.5)。
[0084]
2.5.1.2小鼠mirna antagomir纤维化模型的建立
[0085]
将采购的45只6周龄雌性c57bl/6小鼠分为4组，用于建立日本血吸虫感染和感染治疗模型，分别为mirna antagomir nc组(阴性对照组)、novel mirna-33antagomir组(感染治疗组)、感染组和正常组。mirna antagomir nc和novel mirna-33antagomir溶解在无菌的生理盐水中。
[0086]
在mirna antagomir nc组中，9只雌性c57bl/6小鼠经皮暴露于20
±
1日本血吸虫尾蚴，在小鼠感染日本血吸虫尾蚴7天后，通过尾静脉注射120μl 20nm的mirna antagomir nc(ribo生物)，每周一次，共持续八周。
[0087]
在novel mirna-33antagomir组，18只雌性c57bl/6小鼠经皮暴露于20
±
1日本血吸虫尾蚴，在小鼠感染日本血吸虫尾蚴后7天，通过尾静脉注射120μl 20nm的novel mirna-33antagomir(ribo生物)，每周一次，共持续八周。
[0088]
在感染组，9只雌性c57bl/6小鼠经皮暴露于20
±
1日本血吸虫尾蚴，感染日本血吸虫尾蚴7天后经尾静脉注射120μl生理盐水，每周一次，共持续八周。
[0089]
在正常组，9只小鼠不经任何处理。
[0090]
从第一次静脉注射后的第7周开始采集小鼠的肝组织。
[0091]
2.5.1.3兔纤维化模型的建立
[0092]
(1)为了获得大量日本血吸虫卵，将2.5kg健康雌性大白兔置于解剖板上，剃去腹部毛发，经皮暴露于800
±
20条日本血吸虫尾蚴，感染15min；
[0093]
(2)感染好的兔子取下，置于恒温兔房中饲养6周；
[0094]
(3)在兔子感染日本血吸虫6周后，无痛处死兔子，并采集兔肝脏收取新鲜日本血吸虫卵。
[0095]
2.5.2实验动物肝组织的采集
[0096]
(1)小鼠肝组织的采集
[0097]
采用腹腔注射麻醉剂的方式对小鼠进行无痛处死：用0.15ml的10％戊巴比妥钠溶液(按照雌性c57bl/6小鼠的体重来确定麻醉剂的用量)先使感染日本血吸虫六周的小鼠处于麻醉状态，然后将小鼠轻柔地固定在解剖台上，采集肝组织。所有小鼠的median肝叶留存，以待后续实验使用，left肝叶被用于石蜡切块的制作，right lower肝叶被用于组织总
rna的提取，right upper肝叶被用于肝组织总蛋白的提取。caudate肝叶被用于肝组织的虫卵计数。取好的肝组织用1
×
pbs清洗血迹，以便后续的总rna和蛋白质提取实验操作。
[0098]
(2)兔肝组织的采集
[0099]
感染日本血吸虫六周的兔子经腹腔注射，3ml的10％戊巴比妥钠溶液(按照兔子地体重来去欸的那个麻醉剂的用量)先麻醉，然后，将兔轻柔地固定在解剖台上，以防兔子挣扎，解剖并采集肝组织。摘除兔的整个肝组织，用含有2％青霉素和链霉素的预冷1
×
pbs清洗血迹，以便后续的虫卵提取操作。
[0100]
2.5.3日本血吸虫虫卵的获取
[0101]
(1)在兔子感染日本血吸虫尾蚴6周后，取其肝脏，并在生物安全柜(生物安全柜提前半小时用紫外灭菌)中用高速组织研磨机将雌性大白兔的肝脏研磨成匀浆；
[0102]
(2)匀浆用含有2％青霉素和链霉素的1
×
pbs稀释，然后依次通过80目和100目无菌筛网过滤。将过滤后的兔肝脏匀浆液转移至新的无菌的50ml离心管中；
[0103]
(3)将离心管配平后，置于冷冻离心机中，以300
×
g的离心力，在4℃条件下离心5min；
[0104]
(4)离心结束后，弃去上清液，并将沉淀用含有2％青霉素和链霉素的在4℃预冷的1
×
pbs缓冲液重悬，之后补足至50ml，将离心管配平后，置于冷冻离心机中，以300
×
g的离心力，在4℃条件下离心5min；
[0105]
(5)重复步骤(4)六至十次，直到上清液澄清；
[0106]
(6)在离心结束后，将沉淀转移至1mg/ml的胶原酶iv(2091mg100，德国biofoxx)溶液中在37℃消化2h；
[0107]
(7)将消化好的虫卵即肝组织匀浆，以60
×
g的离心力，在4℃条件下离心5min，然后弃去上清液；
[0108]
(8)用冷的无菌且含有2％青霉素和链霉素的1
×
pbs洗涤，以100
×
g的离心力在4℃下离心5min；
[0109]
(9)重复步骤7六至十次，直到上清液澄清；
[0110]
(10)将洗涤好的日本血吸虫虫卵在含有2％青霉素和链霉素的rpmi-1640培养基中重悬，用100μm的细胞筛网过滤虫卵；并用rpmi-1640重悬虫卵；
[0111]
(11)用台pan蓝溶液检测获取到虫卵的活性；
[0112]
(12)以每孔3ml的量均匀的转移至6孔板中；
[0113]
(13)然后在37℃和5％的二氧化碳培养箱中培养日本血吸虫虫卵
[0114]
(14)每24小时采集一次卵子培养上清液，并储存在-80℃下。
[0115]
2.5.4日本血吸虫虫卵源性外泌体及外泌体源mirna的获取
[0116]
对上清液样品进行超速离心，得到无菌的日本血吸虫虫卵源性外泌体，超速离心操作如下：
[0117]
(1)从-80℃取出收集的日本血吸虫虫卵培养上清液，置于无菌的室温环境下，待其融化；
[0118]
(2)将融化后的上清液在无菌的室温环境下分装至50ml无菌离心管中，并在4℃，200
×
g的条件下离心10min；
[0119]
(3)离心结束后，在无菌的室温环境下缓慢地将上清液转移至新的50ml无菌离心
管中，将离心管置于四度冷冻离心机中，以2,000
×
g的离心力在4℃，条件下离心20min；
[0120]
(4)待离心结束后，在无菌的室温环境下缓慢地将上清液转移至新的50ml无菌离心管中，用电子天平精确的称重并用无菌的1
×
pbs缓冲液配平，将离心管置于四度冷冻离心机中，以10,000
×
g的离心力，高速离心40min；
[0121]
(5)高速离心结束后，在无菌的室温环境下缓慢地将上清液转移至无菌的超速离心专用软管中，用电子天平精确的称重，并用无菌的1
×
pbs缓冲液配平，将软管置于离心套管中，于超速真空离心机中，以110,000
×
g的离心力，在4℃的条件下离心90min；
[0122]
(6)待超速离心结束后，在无菌的室温环境下缓慢地将上清液弃去，并用无菌的1
×
pbs缓冲液轻柔地重悬超离管底部的沉淀，再向超离管中加入无菌的1
×
pbs缓冲液至刻度线，清新沉淀，在4℃，110，000g的条件下超速离心90min；
[0123]
(7)待再次离心结束后，在无菌的室温环境下缓慢地将上清液弃去，并用300μl的无菌的1
×
pbs缓冲液重悬沉淀，最终得到的就是日本血吸虫虫卵源性外泌体
[0124]
(8)将得到的日本血吸虫虫卵源性外泌体分装，并置于80℃条件下保存。
[0125]
得到的外泌体样本，100μl用作透射电镜(tem)检测外泌体的物理特征，100μl用作测序分析，以获得其内容物的基因序列；其中测序服务由上海欧易生物有限公司提供，将获得的mirna序列交予锐博生物合成。本研究主要用到的mirna序列信息如表2-3所示。
[0126]
表2-3 mirna序列信息
[0127]
序列编号mirna序列(5’到3’)seq id no.1novel mirna-33gagugcaguugaaguggcuseq id no.8novel mirna-68aucucggucguuguggugacuuseq id no.9mir-1uggaauguggcgaaguauggucseq id no.10novel mirna-30aagagaggcuguauugaaccseq id no.33novel mirna-30反义链 [0128]
seq id no.2与seq id no.1互补，为5
’‑
agccacuucaacugcacuc-3’；seq id no.32与seq id no.8互补，为5
’‑
aagucaccacaacgaccgagau-3’；seq id no.33与seq id no.10互补，为5
’‑
gguucaauacagccucucuu-3’。
[0129]
2.5.5日本血吸虫虫卵源性外泌体蛋白样本的制作
[0130]
将得到的日本血吸虫虫卵源性外泌体在takara的bca蛋白浓度指南下进行蛋白浓度的测定，操作步骤如下：
[0131]
(1)bsa标准品溶液的配制
[0132]
(a)0.2mg/ml的bsa标准品溶液配制：取120μl的bca standard solution(2mg/ml)，加入1080μl的无菌的1
×
pbs缓冲液稀释，并充分混匀稀释后的标准品溶液；
[0133]
(b)按照以下表格推荐的方法，将标准品按照浓度梯度用无菌的1
×
pbs缓冲液稀释并混匀：
[0134]
表2-4 bsa标准品的稀释
[0135][0136]
(2)工作液的配制
[0137]
取bca的a液和b液，按照a液：b液＝100：1的比例稀释，稀释前计算样品和标准品最终所需的体积，并按照+2孔的量来进行补足。
[0138]
(3)bsa标准品和样品的检测
[0139]
(a)分别取100μl稀释后的bsa标准品溶液和100μl的日本血吸虫虫卵源外泌体样本液，并加入到微孔板中，每个样本做两个平行复孔；
[0140]
(b)加入100μl工作液后，立即混匀；
[0141]
(c)将微孔板置于37℃水浴锅中，反应60min，取出微孔板，冷却至室温；
[0142]
(d)预先打开酶标仪，使其预热，并按照takara的说明书将检测波长设定在562nm处，在0.2ml的微孔板中设置无菌的1
×
pbs缓冲液组，用以校零操作；
[0143]
(e)根据takara标准品测出的od值与指示浓度，绘制标准曲线，并根据实际检测出的样本的od值来测算日本血吸虫虫卵源外泌体蛋白样品浓度。
[0144]
预先将6
×
蛋白上样缓冲液从-20℃取出，并融化至室温，融化好后，用移液器将其充分的混匀，之后，向测定好浓度的日本血吸虫虫卵源外泌体样本中加入适量的6
×
蛋白上样缓冲液，充分混匀，使得蛋白样本于蛋白上样缓冲液充分融合，将混合均匀的日本血吸虫虫卵源外泌体样本100℃金属浴煮10min，使蛋白样本充分变性，之后呢，将蛋白样本置于-20℃保存，以便于后续的免疫印迹实验。
[0145]
2.5.6日本血吸虫虫卵源性外泌体透射电镜负染(tem)
[0146]
(1)将获得的日本血吸虫虫卵源性外泌体重悬，取20μl添加到150目的碳膜铜网中1min，并使用滤纸擦掉剩余液体。
[0147]
(2)用2％磷钨酸对150目的碳膜铜网，进行1分钟的阴染，负染结束后，在室温(rt)下干燥铜网。
[0148]
(3)将干燥好的铜网放置在透射电子显微镜的样品架上，并在80kv的条件下曝光。
[0149]
(4)获取到日本血吸虫虫卵源性外泌体透射电镜负染图。
[0150]
2.5.7日本血吸虫感染小鼠肝脏虫卵计数
[0151]
小鼠肝脏虫卵计数的方法基于之前的研究(chen g,dai y,chen j,et al.oral delivery of the sj23lhd-gst antigen by salmonella typhimurium type iii secretion system protects against schistosoma japonicum infection in mice.plos neglected tropical diseases,2011,5(9):e1313)，并对其进行了修改。
[0152]
(1)小鼠感染日本血吸虫尾蚴并用mirna拮抗剂antagomir治愈6周后，取小鼠肝脏
称重5g，剪碎这5g肝组织，
[0153]
(2)然后将剪碎的组织碎片放入15ml 1％氢氧化钠溶液中，并在37℃下消化2小时，直到肝组织碎片完全消失。
[0154]
(3)消化后，取含有日本血吸虫卵的消化液10μl，在显微镜下计数，每只小鼠的肝脏组织独立计数三次。
[0155]
2.5.8样本蜡块的制备
[0156]
(1)石蜡包埋
[0157]
(a)取出小鼠left肝叶后，放在4％多聚甲醛溶液中固定过夜，以便于后续的操作；
[0158]
(b)固定过后的小鼠left肝叶用纱布包好，放在小烧杯中，流水冲洗过夜；
[0159]
(c)将小鼠left肝叶放在相应浓度的乙醇中进行脱水：第一次呢，在70％的恒温乙醇溶液中浸泡24h；第二次呢，在80％的恒温乙醇溶液中浸泡1h；第三次呢，在90％的恒温乙醇溶液中浸泡30min；第四次呢，在95％的恒温乙醇溶液ⅰ中浸泡30min；第五次呢，在95％的恒温乙醇溶液ⅱ中浸泡30min；第五次呢，在100％的恒温无水乙醇溶液ⅰ中浸泡30min；第六次呢，在100％的恒温无水乙醇溶液ⅱ中浸泡30min；最后呢，将组织在二甲苯/乙醇(1：1)的恒温溶液中浸泡15min；
[0160]
(d)脱过水的组织进行透明，顺序为：在二甲苯/乙醇(1：1)的恒温溶液中浸泡10min；在二甲苯的恒温溶液ⅰ中浸泡10min；最后，在恒温的二甲苯溶液ⅱ中浸泡5min；
[0161]
(e)肺组织浸蜡：石蜡ⅰ、石蜡ⅱ和石蜡ⅲ，组织在三个石蜡缸中各浸泡1h,每个蜡缸中的石蜡温度保持在58℃；
[0162]
(f)小鼠left肝叶置于包埋模具中，加入融化的石蜡，待石蜡凝固成块后，置于4℃保存。
[0163]
(2)石蜡切片
[0164]
(a)对蜡块进行修整，再将其固定在标本台上，转动转轮连续切5μm厚的切片；
[0165]
(b)将切片放在37℃的恒温水浴锅中使其展平，用载玻片捞取；
[0166]
(c)60℃烘箱拷片1h后，放到4℃可以长期储存。
[0167]
2.5.9免疫荧光
[0168]
(1)按照石蜡包埋操作过程的脱水步骤对切片进行脱水；
[0169]
(2)脱水结束后，对小鼠肝组织切片进行抗原修复，切片取出后，被转移到盛满柠檬酸(ph6.0)抗原修复液中，之后，抗原修复操作将会在特定的高压锅内进行。等到高压锅达到预设的温度并且保持均匀出气的状态5min后，停止加热。待高压锅自然冷却降温后，小心地打开高压锅，将切片轻缓的置于1
×
pbs(ph7.4)缓冲液中，，于低匀速地条件在脱色摇床上晃动洗涤5min，共2至4次。洗去多余的抗原修复液体；
[0170]
(3)将修复好抗原的切片稍加用力甩干，之后，用组化笔谨慎地在组织周围画圈(防止抗体流走)；
[0171]
(4)画圈结束后，在圈内滴加对应二抗的血清孵育30min；
[0172]
(5)封闭结束后，操作轻柔地甩掉封闭液，并小心缓慢地在切片上滴加用1
×
pbs缓冲液按一定比例配好的一抗孵育液，之后呢，将切片轻柔地平放于湿盒内，再将保湿盒放入冰箱，在4℃且黑暗无自然光的条件下孵育过夜。(保湿盒内加少量无菌的去离子水，以防止抗体溶液的蒸发)；
[0173]
(6)孵育过夜的切片被从保湿盒内取出，这之后，玻片被小心地置于1
×
pbs缓冲液(ph7.4)中，并将孵育好的切片轻缓地置于脱色摇床上，在低匀速地条件下晃动洗涤5min，共3次。洗涤之后，将切片施加大力的稍甩干操作后，缓慢且精细地在之前画好的组织圈内滴加与一抗相应种属的二抗孵育液(或是二级兔抗，或是二级山羊抗体，或是二级鼠抗)，完全覆盖住切片上的组织，之后，在室温且黑暗的条件下孵育60min；
[0174]
(7)将孵育好二抗的切片取出，然后，轻柔地将切片置于1
×
pbs(ph7.4)缓冲液中，并将赋予好二抗的切片置于脱色摇床上，以固定的不会使液体溢出的低匀速摇动洗涤5min，共3次。洗涤结束之后，在前述用组化笔画出的组织圈内加入自发荧光淬灭剂，进行淬灭5min，淬灭结束后，使用流水冲洗切片20min，以洗去多余的淬灭剂；
[0175]
(8)将冲洗好的切片从流水下取出，谨慎地稍加用力稍甩干后，在之前用组化笔画出的圈内组织圈内，滴加适量地dapi(激发光为蓝色)染液，不可过多的加入，在室温且黑暗的条件下孵育10min；
[0176]
(9)孵育结束后。使用抗荧光淬灭封片剂封片被甩干的切片；
[0177]
(10)之后，在暗房预热好的荧光显微镜被用来采集荧光图像，保存以待后续使用。
[0178]
2.5.10免疫组织化学(immunohistochemistry，ihc)
[0179]
采用ihc法分析mad2l1在ipf患者和小鼠肺纤维化模型肺组织中的表达，方法如下：
[0180]
(1)4％的多甲醛组织固液被用来将新鲜的小鼠left肝叶组织固定，之后，进行常规的石蜡包埋流程，从每个肝组织样本上制备石蜡切片(5μm)。
[0181]
(2)脱水：切片先在60℃烘箱中烤片1h；
[0182]
(3)将制备好的石蜡切片先放入二甲苯ⅰ恒温的溶液中，浸泡10min；之后将其取出，转移到二甲苯ⅱ溶液中，同样地浸泡10min；再之后，切片被从上级溶液中取出后，放入无水乙醇ⅰ恒温的溶液中，浸泡15min；而后，将切片取出置入恒温的95％乙醇ⅱ溶液中2min；将切片从恒温的无水乙醇ⅱ溶液中取出，转入恒温的90％乙醇溶液中浸泡2min；浸泡结束后，将切片取出，转移到恒温的80％酒精溶液中继续浸泡5min；从上级恒温的乙醇溶液中取出切片，置入恒温的70％乙醇溶液中2min；最后用恒温的蒸馏水洗涤2min；
[0183]
(4)通透：组织切片置于保湿盒中并滴加0.3％triton-100对组织进行通透，室温孵育5min；
[0184]
(5)清洗：1
×
pbs缓冲液清洗4.5min，共3次；
[0185]
(6)铁苏木素染色：将切片置于提前配制好的恒温的weigert铁苏木素染液中，在固定的不会使液体溢出的低匀速摇床上染色9.7min；
[0186]
(7)分化：用酸性乙醇分化液分化，并用1
×
pbs缓冲液在固定的不会使液体溢出的低匀速摇床上摇动清洗4.5min，共3次；
[0187]
(8)masson染色：用masson蓝化液返蓝，在固定的低匀速摇床上摇动染色4.8min；
[0188]
(9)水洗：将染色好的切片用蒸馏水洗1min；
[0189]
(10)丽春红品红染色：将水洗好的切片置于丽春红品红染色液中染色10min；
[0190]
(11)酸洗：将染红过的组织切片置于弱酸工作液中，在固定的低匀速摇床上摇动酸洗2min；
[0191]
(12)磷钼酸洗：将上一步酸洗过的组织切片置于磷钼酸工作液中，在固定的低匀
速摇床上摇动酸洗2min；
[0192]
(13)酸洗：将经磷钼酸酸洗过的组织置于弱酸工作液中，在固定的低匀速摇床上摇动酸洗2min；
[0193]
(14)苯胺蓝染色：酸洗结束后，苯胺蓝得到恒温染液被用来染色切片，在固定的低匀速摇床上摇动染色5min；
[0194]
(15)酸洗：将色过的组织切片置于弱酸工作液中，在固定的低匀速摇床上摇动酸洗2min；
[0195]
(16)脱透：切片分别置于70％乙醇的恒温溶液中，浸泡2min；在恒温的80％乙醇的溶液中，浸泡2min；在恒温的90％乙醇的溶液中，浸泡2min；在恒温的95％乙醇的溶液中，浸泡2min；在恒温的100％乙醇ⅰ溶液中，浸泡2min；在恒温的100％乙醇ⅱ溶液中，浸泡2min；在恒温的二甲苯ⅰ溶液中，浸泡2min；在恒温的二甲苯ⅱ溶液中，浸泡2min；
[0196]
(17)封片：中性树胶封片切片，之后在暗房中用普通光学显微镜采集masson染色图像。
[0197]
以上酸洗操作过程中的酸洗液，按照按蒸馏水:乙酸溶液＝2:1比例，提前配制弱酸工作液并置于4℃无光保存。
[0198]
2.5.11细胞的培养
[0199]
(1)细胞复苏
[0200]
(a)depc水配置的75％的酒精被用来谨慎地擦拭超净工作台，之后，紫外照射30min消毒灭菌；
[0201]
(b)长期冻存在寄研所的液氮中的lx-2细胞，被迅速取出后，放在37℃水浴锅(添加青霉素和链霉素进行除菌)里使细胞快速溶解，以避免低温对细胞造成的损伤；
[0202]
(c)将lx-2细胞悬液转移至灭菌过的15ml ep管中，并用完全培养基补足至13ml；
[0203]
(d)1500rpm离心5min，弃掉上清；
[0204]
(e)加入1ml dmem(1
×
)完全培养基，轻柔地吹打混匀，用力过猛可导致细胞的损伤或者死亡，之后，混匀的细胞悬液被轻柔地转移到培养瓶中；
[0205]
(f)再补加4ml的dmem(1
×
)完全培养基，混匀；
[0206]
(g)放在37℃，5％co2的培养箱中培养。
[0207]
(2)细胞换液
[0208]
(a)细胞复苏后，每隔24小时倒掉培养基；
[0209]
(b)加入2ml pbs缓冲液洗去死掉的lx-2细胞；
[0210]
(c)加入5ml新鲜的完全培养基，继续培养lx-2细胞；
[0211]
(3)细胞传代
[0212]
(a)倒掉原来培养基；
[0213]
(b)3ml的预先配置好的无菌1
×
pbs(ph＝7.4)缓冲液，被用来清洗t25培养瓶中的lx-2细胞一次；
[0214]
(c)清洗lx-2细胞结束后，向培养瓶中加入1ml 0.25％的胰蛋白酶，之后，转移至培养箱中在37℃的条件下0.25％的胰蛋白酶作用地更高效，2min后，培养瓶被从培养瓶从培养箱中取出，在显微镜下观察消化后的lx-2细胞，待培养瓶底有大片lx-2细胞浮起时(lx-2为贴壁细胞)，5ml的完全培养基(新鲜的培养基)被加入培养瓶中，以终止0.25％的胰
蛋白酶对lx-2细胞的消化；
[0215]
(d)消化结束后，无菌的15ml离心管被用来盛装lx-2细胞细胞悬液，补足至12ml，轻柔且充分地混匀，在4℃条件下用1500rpm离心5min。
[0216]
(e)离心结束后，小心地弃去上清液避免lx-2细胞的损失，缓慢地添加新鲜的完全培养基培养基1.3ml，然后将lx-2细胞悬液轻柔地混匀后转移至预先灭菌消毒过的t25培养瓶中，继续对lx-2细胞进行传代，待lx-2细胞再次生长至密度达到80％左右时，重复lx-2细胞传代的步骤。
[0217]
(4)细胞冻存
[0218]
(a)待培养瓶中的贴壁lx-2细胞生长密度达到80％左右时，消化lx-2细胞；
[0219]
(b)消化结束后，无菌的15ml离心管被用来盛装细胞悬液，且新鲜的完全培养基被用来补足至13.5ml，轻柔且充分地混匀，在4℃条件下用1500rpm离心5min；
[0220]
(c)离心后，谨慎地弃去上清液，避免将lx-2细胞沉淀荡起，用1ml的无血清细胞快速冻存液轻柔地吹打lx-2细胞沉淀，重悬lx-2细胞；
[0221]
(d)直接放入-80℃保存箱，冻存lx-2细胞，最后置于液氮中长期保存。
[0222]
2.5.12 lx-2的转染
[0223]
mirna模拟物(mimic)和ribofect
tm cp转染试剂在锐博生物合成与采购。
[0224]
(1)将粉末状的mirna模拟物置于4℃10000rmp，离心1min，然后用无酶枪头吸取0.25ml的depc水溶解5nmol的mirna模拟物，配制成20μm的母液，以10μl/管分装，-80℃长时间保存；
[0225]
(2)ribofect
tm cp转染试剂盒用pbs将10
×
ribofect
tm cp buffer稀释成1
×
ribofect
tm cp buffer；
[0226]
(3)将ribofect
tm cp reagent在4℃1500rmp的离心机中，离心5min后，备用；
[0227]
(4)将lx-2细胞以每孔1
×
105个的密度接种在6孔板中，待lx-2细胞贴壁并生长至密度55.7％左右时进行转染；
[0228]
(5)转染试剂复合物配制：将8μl mirna模拟物，12μl的1
×
ribofect
tm cp reagent，120μl的1
×
buffer混匀，按照说明书的建议，室温孵育15min；
[0229]
(6)将6孔板中的完全培养基更换成1360.00μl的dmed(1
×
)培养基，对lx-2细胞进行4h的饥饿处理；
[0230]
(7)饥饿处理lx-2细胞结束后，将转染试剂复合物加到lx-2细胞中，轻缓地混匀；
[0231]
(8)lx-2细胞被置于37℃培养箱中继续培养。培养24h后，收取rna材料。若是收取蛋白材料，培养48h；
[0232]
(9)进行qrt-pcr和western blot等操作检测肝纤维化指标。
[0233]
2.5.13细胞处理
[0234]
(1)待lx-2细胞生长密度达到t25培养瓶的80％时，用0.25％胰蛋白酶消化lx-2细胞，进行细胞计数，根据lx-2细胞状态以合适的密度接种于6孔板上。
[0235]
(2)当细胞密度达到60％左右时，分别使用novel mirna-33mimic和mirna mimic nc转染lx-2细胞，用无双抗培养基培养24h，进行总rna的提取；培养48h，进行总蛋白的提取。
[0236]
2.5.14总rna的提取
[0237]
总rna的提取根据rna提取试剂盒(rnaiso plus，货号：9109)的说明书进行。
[0238]
(1)组织样本的处理：将在-80℃储存的小鼠right lower肝叶样本放入1.5ml无rna酶的离心管中，每管加1mltrizol，并用组织研磨仪(qiagen)研磨，研磨结束后室温孵育5min；
[0239]
(2)孵育结束后，在4℃，12000rpm地条件下离心5min；
[0240]
(3)离心结束后，弃去沉淀，小心的吸取上层液体并转移至1.5ml无rna酶的离心管中；
[0241]
(4)细胞样本的处理：弃掉原来的培养基，在6孔板中每孔用2ml的pbs清洗两遍，每孔加入1ml的trizol，室温消化5min，将lx-2细胞吹打下来，收入1.5ml无rna酶的离心管中；
[0242]
(5)每1.5ml的无酶离心管中加入200μl的氯仿，剧烈摇动30s(但不可放置在涡旋振荡仪上操作)，室温的环境下孵育5min；
[0243]
(6)在4℃，12000rpm地条件下离心15min；
[0244]
(7)待离心结束后，在通风橱中，离心好的上层水相被缓慢地转移到新的1.5ml无rna酶的离心管中(大约能转移500μl得到水相)，在吸取上层水相地时候，要尽可能的谨慎，避免吸到下层的酚相，以免影响rna的纯度，之后，向ep管中加入500μl异丙醇，充分且轻柔地混匀，在rt环境下孵育10min；
[0245]
(8)孵育结束后，将ep管放入离心机中，在4℃，12000rpm的条件下离心10min；
[0246]
(9)轻柔的弃去上清液后，留下管底部的沉淀，在去上清的时候，要尽可能地小心，避免将rna沉淀弃去，之后，向离心管中加入1ml的用depc水配制的75％乙醇，轻柔的混匀；
[0247]
(10)在4℃，8000rpm地条件下离心5min；
[0248]
(11)离心后，彻底弃去上清液(操作轻柔且缓慢)，留下rna沉淀，用20μl的depc水溶解rna沉淀；
[0249]
(12)测rna浓度及纯度，使用nano drop 2000测定浓度后，及时在冰上按照说明书得到指导，进行逆转录操作，并将余下的rna样本置于-80℃长期保存。
[0250]
2.5.15 rna逆转录
[0251]
(1)总rna逆转录
[0252]
(a)配制rna和gdna remover混合体系并混匀，待pcr温度升至42℃时，将混合体系放入pcr仪中，加热2min，结束后立刻放在冰上15min。
[0253]
表2-5 gdna去除体系
[0254][0255][0256]
(b)配制反转录体系，将试剂用掌上离心机轻微离心混匀，再将5
×
rt supermix加入步骤(a)的混合液中，20μl/管。
(seq id no.7)。
[0272]
逆转录产物可直接用于下游实验，也可置于4℃短暂放置，3-6个月内-20℃保存，长期存放在-80℃冰箱，cdna小份分装，避免反复冻融。
[0273]
2.5.16 qrt-pcr
[0274]
(1)配制qrt-pcr反应体系；
[0275]
表2-10 qrt-pcr反应体系
[0276][0277]
(2)qrt-pcr反应条件为：95℃的条件下预变性5min后，95℃条件下变性15s；60℃的条件下退火延伸30s；整个反应持续40个循环；并在72-95℃收集融解曲线；
[0278]
(3)每个样品做3-5次的重复，gapdh为内参，运用2^(
‑△△
ct)法算出相应的ct值，实验做相应的重复。
[0279]
表2-11正向引物和反向引物序列
[0280]
[0281][0282]
2.5.17总蛋白的提取及浓度检测
[0283]
(1)组织蛋白的提取
[0284]
(a)把小鼠right upper肝叶取下后，放入ripa(中强度)的裂解液中(含有相应比例的蛋白酶和磷酸酶抑制剂)，按照上海雅酶生物公司的建议，组织：裂解液＝4：1的比例配置好于4℃待用；
[0285]
(b)使用组织研磨仪将小鼠right upper肝叶组织打碎，放在冰上裂解30min；
[0286]
(c)12000rpm，4℃离心15min，取上清；
[0287]
(d)将小鼠组织蛋白匀浆液按浓度梯度(5倍、10倍、15倍)稀释后，用bca法测定蛋白浓度，选择合适的稀释倍数，使其最终浓度在2mg/ml，每管加适量在室温预先融化好的6
×
蛋白上样缓冲液(全式金生物)，在100℃金属浴的条件下煮10min，使其充分变性；变性结束后，对蛋白进行分装，然后-20℃储存。
[0288]
(2)细胞蛋白的提取
[0289]
(a)向6孔板中每孔加入1ml的1
×
pbs清洗两遍，孔数：裂解液＝1：200的比例，提前配置好ripa的裂解液(含有相应比例的蛋白酶和磷酸酶抑制剂)，之后，向6孔板中加入200μl的混合ripa裂解液；
[0290]
(b)用细胞刮板轻柔且仔细地从6孔板中刮下lx-2细胞，将刮下来的细胞收集到无菌的1.5ml ep管中,放于4℃摇床，充分裂解20min；
[0291]
(c)12090g，4℃的条件下，离心15min，收集上清液；
[0292]
(d)将蛋白匀浆液浓度梯度稀释后，用bca法测定蛋白浓度，选择合适的稀释倍数(本研究选取的使稀释5倍后的蛋白样品液)，使其最终浓度波动在2mg/ml的范围内，每管加适量在室温预先融化的6
×
蛋白上样缓冲液(全式金生物)，在100℃金属浴煮10min条件下，使其充分变性；变性结束后，对蛋白进行分装，然后-20℃储存。
[0293]
(3)bca法测蛋白浓度
[0294]
采购自日本takara公司的bca试剂盒，将在本研究中被用来测定小鼠组织和lx-2细胞蛋白样品的浓度。
[0295]
(1)配制bca工作液(a液：b液＝100：1)，配制完成后，放在冰上待用；
[0296]
(2)在八连管中，用在4℃预冷的无菌的1
×
pbs缓冲液(ph＝7.4)，稀释2mg/mltakara的bsa蛋白标准品(标准品在4℃保存，现配现用)使得标准品浓度分别为125μg/ml、250μg/ml、500μg/ml、750μg/ml、1000μg/ml、1500μg/ml、2000μg/ml；
[0297]
(3)稀释好的蛋白标准品25μl被用寄研所的200微升的排枪加入0.2ml的微孔板中，并向其中添加200μl的工作液；
[0298]
(4)用无菌的1
×
pbs缓冲液稀释小鼠或者lx-2细胞的蛋白样品(稀释倍数分别为5倍、10倍、15倍)，并在预先加入200μl的工作液的0.2ml的微孔板中分别加入稀释好的蛋白样品25μl，使得最终的体积为225μl，并做好相应的标记；
[0299]
(5)置于37℃的条件下孵育30min；
[0300]
(6)孵育结束后，用寄研所的酶标仪测定蛋白样品浓度与标准品的浓度，测定条件为a562 nm处的od值，根据测定的样本标准曲线，计算蛋白样品的浓度，并根据合适的稀释倍数将蛋白样品稀释(本实验选取5倍稀释)，分装并置于-20℃储存，在-80℃条件下长期保存。
[0301]
2.5.18免疫印迹(western blot，wb)
[0302]
(1)取两块预先清洗干净并在烘箱中烤干的制胶玻璃板1.0mm的厚板与标准的薄板，将二者对齐后放在制胶架上卡紧；
[0303]
(2)轻柔的灌注分离胶，尽量避免产生气泡，使用寄研所的异丙醇溶液来对下层分离胶进行液封，室温放置待其凝固；
[0304]
表2-12分离胶和浓缩胶的配制
[0305][0306]
(3)等下层分离胶和用来液封的异丙醇之间出现一条较为明显的折射线时，即代
表下层分离胶的凝固(可根据室温来增减液封的时间)，弃掉用来液封的异丙醇，用ddh2o清洗三遍，并用吸水滤纸小心的吸去多余的水分，之后，缓慢地灌入带有颜色指示的上层浓缩胶，并插入合适规格(1.0mm或者1.5mm)的样本梳子；
[0307]
(4)在4℃预冷的1
×
电泳液被提前准备好，并倾倒至电泳槽推荐的刻度线处，缓慢拔出样本梳子，加入10μl蛋白样品(lx-2细胞蛋白样品或者小鼠组织蛋白样品)(每泳道的蛋白总含量为20μg)；
[0308]
(5)使用90v的电压进行电泳；
[0309]
(6)电泳结束后，打开制胶玻璃板，根据蛋白marker的位置和所需目的蛋白胶的位置切出合适的胶块，再剪裁适合凝胶大小的pvdf膜并用寄研所的甲醇激活2min；
[0310]
(7)将切好得到胶置于pvdf膜上，将pdf膜放置转膜海绵中，将整个海绵放置在金斯瑞的转膜夹板上，夹紧膜板，选择合适的湿转程序，进行转膜；
[0311]
(8)待转膜结束后，取下转膜夹板，并小心地取走转膜海绵，在将pvdf膜取出迅速放入专用的洗膜盒子内，使用1
×
tbst缓冲液轻柔地清洗5min，共2次；
[0312]
(9)将膜置于1
×
封闭液，封闭半个小时；
[0313]
(10)封闭结束后，谨慎地倒掉无蛋白快速封闭液，并用寄研所的1
×
tbst缓冲液轻柔地洗涤pvdf膜5min，共3次；
[0314]
(11)洗膜结束后，用合适的一抗(α-sma，col 1α1，col 3α1，tgf-βr1等等)4℃过夜孵育；
[0315]
(12)一抗孵育结束后，将一抗倒掉，使用寄研所的1
×
tbst缓冲液轻柔地清洗5min，共5次；
[0316]
(13)洗膜结束后，将含有蛋白样品的pvdf膜置于二抗溶液(二级兔抗或者二级鼠抗)中，室温摇床孵育2h
[0317]
(14)二抗孵育结束后，使用寄研所的1
×
tbst缓冲液轻柔地清洗5min，共2次；
[0318]
(15)洗膜结束后，在pvdf膜上滴加适量ecl超灵敏化学发光液(a液：b液＝1：1比例避光配制，现配现用，不可过早的配制显色液)，在荧光成像仪内选择合适的时间曝光并拍照；
[0319]
(16)用image j软件分析蛋白条带并测定灰度值。
[0320]
表2-13免疫印迹所需的一抗
[0321]
[0322]
2.5.19 3'-非翻译区(utr)荧光素酶报告基因的构建
[0323]
根据mirdb在线生物信息学分析软件，新mirna-33的种子序列被预测为补充tgf-βri的3'utr。为了检测tgf-βri是否是novel mirna-33的靶点，根据tgf-βri的3’utr序列信息和特定的tgf-βri突变位点，通过化学合成tgf-βri的野生型(wt)3’utr和tgf-βri的突变型(mut)3’utr，并将其克隆到pmir rb report(pmirglo)双荧光素酶载体中(图7)。
[0324]
(1)连接反应操作如下：
[0325]
(a)将合成的野生型目的片段或者特定位点突变的突变型目的片段dna 2μl；
[0326]
(b)准备好的载体0.5μl；
[0327]
(c)预先备好的快速连接液5μl；
[0328]
(d)之后，用灭菌去离子水补足到10μl，
[0329]
(e)在预热好的pcr仪器中在16℃的条件下连接30min。
[0330]
(2)转化：
[0331]
(a)100μl dh5α的感受态细胞被提前准备妥当，将连接反应结束后的产物与感受态的dh5α细胞混匀，并在冰上孵育1800s。
[0332]
(b)将上述转化液转移至含有2％青霉素于双链霉素的42℃水浴锅中，快速地孵育90秒，这之后，立即置于冰上冷却5min。
[0333]
(c)冷却结束后，900μl在37℃条件下预热的寄研所的lb(不含抗生素)培养基被加入混合液中，之后，将培养基在150rpm、37℃的条件下，持续振荡培养45min。
[0334]
(d)摇菌结束后，在4℃，2500rpm的条件下离心5分钟，离心结束后，弃掉上清液，仅留存100μl的菌液，将其轻柔的混匀后，lb固体琼脂糖培养基(amp抗生素浓度为100μg/ml)被用来培养增殖后的菌液，在超净工作台中，轻柔地将涂布上来地菌液划开。
[0335]
(e)待平板表面略微干燥后，将平板倒置过来，并在37℃的条件下培养14-18小时。
[0336]
(3)菌落pcr鉴定：
[0337]
从上述转化好的平板上挑取母单菌落，并将母菌落溶到3μl得的无菌去离子水中。之后，吸取0.5μl的菌液做模板，在寄研所的pcr仪上进行pcr操作。
[0338]
鉴定pcr的反应体系设计为10μl总体系：
[0339]
(a)取预先准备妥的10
×
taq buffer buffer 1μl；
[0340]
(b)取预先准备妥的25mm mgcl
2 1.6μl；
[0341]
(c)取预先准备妥的2.5mm dntp mix 1μl；
[0342]
(d)取预先准备妥的载体上下游引物(10μm)各0.5μl；
[0343]
(e)取预先准备妥的taq dna聚合酶(2.5u/μl)0.3μl；
[0344]
(f)取预先准备妥的dna模板0.5μl(约100ng)；
[0345]
(g)之后，用灭菌过的无rna酶水补足10μl。
[0346]
配置好反应体系后，将上述反应体系置于寄研所的预先设置好工作程序的pcr仪器中，反应条件为如下：
[0347]
(h)在bio-radpcr仪器上95℃的条件下预变性181s；
[0348]
(i)预变性之后，每个循环内95℃变性32s；
[0349]
(j)56℃退火；
[0350]
(k)退火结束后，72℃延伸65s；
[0351]
(l)反应持续20个循环；
[0352]
(m)循环结束后，在72℃的条件下继续延伸181s；
[0353]
(n)pcr结束后，在4℃的条件下保存产物。
[0354]
实验共挑取5个菌落，分别进行pcr操作。pcr的产物送往锐博生物进行测序。
[0355]
(4)菌落扩大培养提取质粒：
[0356]
从锐博生物测序正确的结果中挑取菌落，从单菌落中挑取对的母菌种，4ml的lb琼脂糖培养基(amp抗生素浓度为100μg/ml)被用来培养母菌种，之后，将菌管置于220rpm 37℃的摇床中摇菌培养12h。然后进行质粒的抽提操作。
[0357]
2.5.20靶点验证实验报告实验步骤
[0358]
(1)37℃，5％co2的培养箱被预先用培养箱除菌剂清理干净，293t细胞被常规培养于其中；
[0359]
(2)将总细胞数为104个293t细胞，接种于96孔平底细胞培养板中，细胞被培养在寄研所的细胞培养箱24h后，用于后续的实验；
[0360]
(3)mirna-33mimics或mimic nc被稀释在10μl的opti-mem培养基中(不含双抗)；
[0361]
(4)靶基因(本研究的靶基因为tgf-βr1)的3’utr双报告基因野生型载体野生型或突变载体被稀释在不含双抗的15μl的opti-mem培养基中；
[0362]
(5)0.25μl的lipofectamine
tm 2000转染试剂被25μl的opti-mem培养基稀释(不含双抗)；
[0363]
(6)将步骤(3)(4)(5)的三种试剂混合均匀，共50μl，室温的条件下孵育20min；
[0364]
(4)孵育结束后，将质粒、mirna-33mimic与nc mimic加入细胞孔中，在加入预混液地时候先将每孔中的培养基吸走50μl，然后再加入上述50μl混合液，使得最终每孔细胞培养基的总体积为100μl。其中mirna-33mimic与nc mimic转染浓度均为50nm，而质粒浓度为250ng每孔，每组设置3个复孔。共培养6h后，再向每孔中加100μl的新鲜完全培养基。
[0365]
(5)将平衡至室温的luciferase底物与luciferase buffer现配现用，取配置好的luciferase底物以35μl每孔的量加入转染48小时后的293t细胞中，在添加底物前，弃去培养板中的废培养基，并加入1
×
pbs缓冲液，以35μl每孔的量，在摇床上振荡10min使其混合均匀；
[0366]
(6)孵育结束后呢，向步骤(5)中的培养基中加入30μl的终止反应液，在摇床上振荡10min，使其充分反应；
[0367]
(7)荧光照度计被用来测定双荧光素酶载体的荧光值。
[0368]
3.1来自日本血吸虫虫卵源性外泌体的鉴定
[0369]
为了鉴定日本血吸虫虫卵源性外泌体，本研究参考了先前报道的外质体标记蛋白，初步鉴定了日本血吸虫虫卵源性外泌体。具体而言，我们通过免疫印迹和透射电镜鉴定了获得的日本血吸虫虫卵源性外泌体。本研究免疫印迹结果表明，日本血吸虫虫卵源性外泌体中含有flotilin-1、hsp70等蛋白标记，与之前的研究报道(xue j j,et al.statistical analysis of the heart and lung mass in forensic anatomical cases and its forensic significance.fa yi xue za zhi,2019,35(6):651-656；bai c,et al.cryopreservation disrupts lipid rafts and heat shock proteins in yellow catfish sperm.cryobiology,2019,87:32-39)一致(图2a)。此外，为了验证外泌体
agomir诱导的纤维化小鼠肝组织提取了总rna，并进行了qrt-pcr(见本文2.5.14到2.5.16部分)，结果显示α-sma、col 1α1和col 3α1的mrna水平上调(图4b)。此外，mirna-agomir诱导的纤维化小鼠肝组织的western blot实验(见本文2.5.17和2.5.18部分)结果显示，α-sma、col 1α1和col 3α1的蛋白质水平上调(图4c)，表明注射novel mirna-33agomir的小鼠肝纤维化得到促进。本研究的结果表明，novel mirna-33agomir可以在小鼠体内加工和成熟，并且在促进小鼠肝纤维化的进程中发挥作用。
[0377]
3.5抑制来自日本血吸虫虫卵源性外泌体的新型mirna可延缓小鼠血吸虫病肝纤维化
[0378]
在揭示本研究所提起的novel mirna-33agomir可促进wt c57bl/6雌性小鼠的肝纤维化后，发明人预测抑制该分子可能具有治疗潜力。本研究采用novel mirna-33antagomir来对感染日本血吸虫的小鼠进行治疗。masson染色显示(分组见本文2.5.1.2部分)，novel mirna-33antagomir组(sj+antagomir novel 33组)与mirna antagomir nc组(sj+antagomir nc组)和感染组(sj组)相比，novel mirna-33antagomir组的肝肉芽肿周围的胶原区域减少(图5a，6b)，而三组之间肝脏虫卵数量没有统计学差异(图5c)。此外，结果显示，与正常组(normal组)小鼠相比，感染组感染日本血吸虫6周后，小鼠血清和肝组织中的novel mirna-33含量显著增加(图5d)，这表明在日本血吸虫感染后小鼠体内有novel novel 33的表达并且被加工成熟。除此之外，qpcr结果显示，与antagomir nc组相比，novel mirna-33antagomir组的α-sma、col 1α1和col 3α1的表达在mrna水平下调(图6)。同时，免疫荧光分析显示，当小鼠接受novel mirna-33antagomir治疗时，novel mirna-33antagomir组与mirna antagomir nc组(图5e)相比，α-sma、col 1α1的表达下调。综上，小鼠在感染日本血吸虫尾蚴后，可分泌成熟的novel mirna-33；并且在使用novel mirna-33antagomir治疗后小鼠的纤维化程度有所减轻，这提示novel mirna-33antagomir可以在治疗日本血吸虫并肝纤维化有着潜在的作用。
[0379]
3.6 tgf-βri是来自日本血吸虫虫卵源性外泌体新型mirna-33的靶基因
[0380]
在经过阶段性的实验之后，本研究采用mirdb软件进行在线生物信息学分析，来预测新mirna-33的靶基因。根据mirdb结果显示，tgf-βri可能是新mirna-33的潜在靶基因，同源性分析表明，新mirna-33序列中的7个碱基位置与tgf-βri 3’utr的碱基互补(图8a)。为了确定novel mirna-33是否直接与该位点结合，并进一步验证novel mirna-33的靶基因，我们利用双荧光素酶基因报告载体系统构建了包含tgf-βri的wt 3'utr(tgf-βri3'utr-wt)和突变体(tgf-βri 3'utr-mut)以及novel mirna-33的互补位点。novel mirna-33mimic的双荧光素酶分析显著降低tgf-βri 3’utr荧光素酶的活性，但对突变报告荧光素酶的活性没有影响，而模拟物的对照组对wt或突变荧光素酶的活性没有影响(图8b)。虽然这个结果与的本研究的qpcr结果所相反，我们认为双荧光素酶基因报告系统的相反结果可能与mirna的正调控靶基因有关(vasudevan s,tong y,steitz j a.switching from repression to activation:micrornas can up-regulate translation.science(new york,ny),2007,318(5858):1931-1934)，但是，最近的研究证实双荧光素酶基因报告系统可能会出现相反的结果(wu g q,wang x,zhou h y,et al.evidence for transcriptional interference in a dual-luciferase reporter system.sci rep,2015,5(17675))。所以，本研究实际得出的结果提示mirna的正向调控靶基因。另一方面，新
型mirna-33抑制剂增强了wt和突变报告荧光素酶活性。此外，用新型mirna-33模拟物转染lx-2细胞24小时后，tgf-βri的表达在mrna水平上调(图8c)，并且，在lx-2细胞被新型mirna-33模拟物转染48小时后，tgf-βri在蛋白质水平也上调(图8d)。这些结果提示新型mirna-33和tgf-βri的3’utr之间存在相互作用。
[0381]
3.7来自日本血吸虫虫卵源性外泌体的新型mirna-33通过tgf-β/smad3信号通路促进肝纤维化
[0382]
之前的研究已经报道，成熟的tgf-β1与i型和ii型细胞表面受体复合物(tβri和tβrii)相结合，以此来将信号从胞外传递到细胞内部，而成熟tgf-β分子受体复合物由一个富含半胱氨酸的小细胞外区域(tβri)和一个主要由激酶结构域组成的细胞内区域(tβrii)组成。在tgf-β/smad信号传导的途径中，tgf-βi与tgf-βr ii先结合后启动细胞内信号的传导，然后激活tgf-βri，从而，收到信号的使smad 2和smad 3蛋白的磷酸化；随后，磷酸化的smad 2和smad 3与smad 4加快了寡聚复合物的形成，这些寡聚复合物进而高效的转移到细胞核内，在核内作为战略的主战场，特异且专项的调节靶基因的转录。这些迹象表明受激后的smad 2和smad 3磷酸化为tgf-β细胞内信号的传导做出了巨大贡献。此外，我们还知道许多成纤维细胞基因(胶原)和标记物(如α-sma)的表达依赖于smad 3，磷酸化的smad 3直接参与胶原分子与α-sma的dna序列结合过程，从而为肝纤维化的发生提供了重要支撑。从结果(图8e)中，可知novel mirna-33可上调tgf-βri，这有助于smad3的磷酸化和促进lx-2细胞的纤维化。qpcr和western印迹结果显示，与对照组相比，新mirna-33转染组的tgf-βri在mrna和蛋白质水平均显著上调。i型和ii型细胞表面受体复合物可以激活smad3的磷酸化，smad3进入细胞核并与核胶原基因结合，从而诱导胶原过度表达并促进纤维化。
[0383]
基于该研究结果提出了本发明，公开了一种促日本血吸虫肝脏纤维化的mirna分子。所述促日本血吸虫肝脏纤维化的mirna分子为novel mirna-30、novel mirna-33、novel mirna-68、novel mirna-30mimic、novel mirna-33mimic、novel mirna-68mimic、novel mirna-30agomir、novel mirna-33agomir或novel mirna-68agomir，以及它们可用于制备治疗日本血吸虫病药物，尤其是具有缓解或阻断肝纤维化作用的治疗日本血吸虫病药物。本发明还公开了一种抑制日本血吸虫mirna的拮抗剂——novel mirna-30antagomir、novel mirna-33antagomir或novel mirna-68antagomir，且它们可用于制备治疗日本血吸虫病药物，尤其是具有缓解或阻断肝纤维化作用的治疗日本血吸虫病药物。
[0384]
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。